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▸ FMI次亜塩素酸水の溶液コロナウイルスに対する失活効果測定
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▸ 二酸化塩素製剤によるO157に対する殺菌効力試験

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▸ 除菌消臭材の犬パルボウイルスに対する不活化効果に関する試験

FMI次亜塩素酸水(商品名ジアユーズ)のコロナウイルス溶液
に対する失活効果測定

*国立病院機構仙台医療センターウイルスセンターにてセンター長医師西村秀一先生の指導の下、実施

1.概要

•目的 : 次亜塩素酸水 商品名ジアユーズ によるコロナウイルス培養液サンプルに対する不活化効果の検証

• 方法: 次亜塩素酸水とコロナウイルス液を等量混合したテストサンプルと、
次亜塩素酸水と精製水 /MEM 培養液を等量混合したコントロールサンプルに、
細胞変性効果試験 TCID 50 を実施し、その結果を比較検討することによって、
次亜塩素酸水のコロナウイルス不活化効果を判定しようとした。

• 結果: 200ppm の次亜塩素酸水溶液 商品名ジアユーズ は、
1wt% のトリプシンを含むコロナウイルス 229E 水溶液に対して優れた不活化効果を発揮し、
1 分間の感作時間で 99.96% 以上の不活化率を示した。

2.方法

1)測定条件

1.1 試験ウイルス: コロナウイルス(229E)
1.2 試験消毒液 : 200ppm 次亜塩素酸水
1.3 試験場所:仙台医療センターウイルスセンター
1.4 日程 :2020年3月12日、3月12日~3月18日培養操作(incubation)、3月18日測定終了・結果報告書
1.5 担当: ウイルス培養・感染価測定Isolde Dapat, PhD(ウイルスセンター)
温湿度消毒環境の設定と消毒操作阪田(メディエアジャパン)

2)細胞変性効果試験(TCID50*)手順

3)細胞毒性試験手順

本報告書におけるコロナウイルス229E の
不活化効果の検証試験では、ウイルスの増殖にアカゲザル由来の腎臓細胞 LLC MK2 を使用した。
図1の HClO の消毒剤 A をウイルス液 B と混合して、培養細胞 LLC MK2 に接種する際、
事前に培養細胞が消毒液 A の毒性によって細胞がダメージを受けない消毒液の濃度範囲をウイルスを使用しない細胞毒性試験で明らかにする必要がある。
培養細胞がダメージを受ける濃度条件下では、ウイルスが健全な細胞に感染して、細胞変性を起こすか否かでウイルス感染価を判定する TCID 50 の手法そのものが適用できない。

3.結果

1)細胞変性効果試験(TCID50*)結果

2)細胞毒性試験結果

図2のの細胞毒性試験結果は、2倍希釈すれば細胞毒性が弱まり、 Control に近づく。
図 1 を見てわかるように、200ppm 次亜塩素酸水Aは、ウイルス液Bと等量混合される際に既に 2倍希釈されている。
従って、(A+B)の混合液は、薄めることなく、そのままの濃度で細胞変性効果試験( TCID50 **)を実施し、表2の不活化率を求めることができた。

3)試験結果のまとめ

200ppmの次亜塩素酸水溶液“ジアユーズ”は、1wt%のトリプシンを含むコロナウイルス229E水溶液に対して優れた不活化効果を発揮し、1分間の感作時間で 99.96% 以上の不活化率を示した。
現在の COVID-19コロナウイルスに汚染された表面に対しても、スプレー噴霧による濡れ面を形成することによって、速やかな不活化除染作用を発揮することが可能である。

空気清浄技術の浮遊インフルエンザウイルス不活化効果評価

インフルエンザウイルスについて

インフルエンザウイルスにはA、B、Cの3つの型がある。
現在、インフルエンザウイルスで流行を起こすのはH1亜型(ソ連カゼ)、
H3亜型(香港カゼ)などのA型と、B型である。
ウイルスの構造を右の模式的に示す。
インフルエンザウイルスの型は核タンパク質(NP)の抗原性の違いによって分類され、
それらはさらに、ウイルス表面タンパク質であるヘマグルチニン
(haemagglutinin:以下HAと略す)と
ノイラミダーゼ(neuraminidase:以下NAと略す)の抗原性の違いによって亜型に分類される。
ちなみに死者のでるA型については、ソ連カゼはH1N1型、香港カゼはH3N2型である。

1.浮遊インフルエンザウイルス感染性と温湿度の関係

1)Harperによる温湿度依存性解明

著者: Harper, G.J.
論文名:Air-bone micro-organisms: survival test with
four viruses.
雑誌名:J Hyg Camb. Vol.59, (1961) p.479~86

図1~3にまとめた。湿度が高いほど、また温度が高いほど、浮遊インフルエンザウイルスは不活化するという結果となっている。
相対湿度が50%前後を超えると、浮遊インフルエンザウイルスの不活化は著しい。

2.浮遊インフルエンザウイルス感染性と温湿度の関係

2)仙台医療センターウイルウセンターにおける温湿度依存性解明

著者: 西村秀一他
論文名: (B-7) くしゃみによるエアロゾル粒子と空中エアロゾル中のインフルエンザウイルスの活性の解析
Analyses on the aerosol particles by sneezing and the viability of influenza virus
in the air-borne particles.
雑誌名:第25回空気清浄とコンタミネーションコントロール研究大会予稿(2007) p.81~83.

図4~5にまとめた。湿度が高いほど、また温度が高いほど、浮遊インフルエンザウイルスは不活化するという結果となり、Harperの結果と一致した。
また、詳細はここでは省くが、インフルエンザの種類A,B,Cを問わず、温湿度依存性は変わらなかった。

3.浮遊インフルエンザウイルス不活化効果の評価

1)空気清浄機の浮遊ウイルスに対する除去性能評価試験方法

2011 年(平成23 年)7 月4 日制定
一般社団法人日本電機工業会
以下、抜粋
4.試験微生物
WHO ガイドライン及び「国立感染症研究所病原体等安全管理規程」においてBSL2(バイオセフティーレベル2;Biosafety Level 2)以上に区分されている微生物(インフルエンザウイルス等)の使用にあたっては、病原体等の管理と使用に関する現行の法律および指針の順守が必要である。

1) 大腸菌ファージと宿主菌
2) インフルエンザウイルスA 型と宿主細胞:(下記は代表例)
① Influenza A virus H1N1(A/PR/8/34) ATCC VR-95 等
② Influenza A virus H3N2 (A/Aichi/2/68) ATCC VR-547 等
阪田コメント:1)の大腸菌ファージは、大腸菌に感染して殺すウイルスのこと。
大腸菌ファージが殺すのは大腸菌だけで、ヒトには全く無害なウイルスである。
インフルエンザウイルスとは全く異なる種類のウイルスで、浮遊インフルエンザウイルスの不活化効果を評価するために、インフルエンザウイルスと代替することは無理がある。
現在国内で、2)のインフルエンザウイルスA 型を使用して空気清浄機を評価できるのは、仙台医療センターウイルスセンターのみである。

2)極微量消毒ガスを用いた浮遊ウイルス不活化効果の評価

浮遊インフルエンザウイルスを不活化可能なヒトの健康に害を及ぼさない極微量消毒ガス(数ppb~50ppb)としては、二酸化塩素、オゾン、過酸化水素、次亜塩素酸、等がある。
二酸化塩素については、不活化効果の詳細が図6のように公表されている。

環境感染誌Vol. 32 no. 5, 2017, p.243-249
低濃度二酸化塩素による空中浮遊インフルエンザウイルスの制御
―ウイルス失活効果の湿度依存性―
西村秀一他

二酸化塩素ガス以外のガス種についても、次亜塩素酸を除き、同等の失活特性が得られている。

3)FMI(次亜塩素酸)を用いた浮遊ウイルス不活化効果の評価

FMIによる極微量次亜塩素酸ガス発生は、従来、他のガス種では不可能であった室温30-35%RHの乾燥雰囲気中における浮遊インフルエンザウイルスの失活が可能であることが明らかになった。
図6に示したように、他のガス種が50%RHを超える高湿度雰囲気中でのみ、浮遊ウイルス失活効果を有する。
一方、次亜塩素酸ガスは、図7に示したように、30-35%RHの乾燥雰囲気中においても浮遊ウイルス失活効果を有する。
室温下で、50%RH以上に湿度を高めることは、カビ類の発生を容易にし、肺炎やアレルギーの原因となりうる。FMIが30-50%RHの乾燥雰囲気中で失活効果を有することは、画期的な特性といえる。

「インフルエンザウィルスの失活装置及び失活方法」特許取得証

次亜塩素酸水(商品名ジアユーズ)の溶液ノロウイルスに対する失活効果測定

*国立病院機構仙台医療センターウイルスセンターにてセンター長医師西村秀一先生の指導の下、実施

1.概要

• 目的: 次亜塩素酸水 商品名ジアユーズ をノロウイルス培養液サンプルに混合した場合、
及びノロウイルス培養液のガラス表面塗布乾燥した汚染表面に対してスプレー噴霧した場合、
それぞれの不活化効果の検証する。

• 方法: 次亜塩素酸水とノロウイルス液を等量混合したテストサンプルと、
精製水 /MEM 培養液とノロウイルス液を等量混合したコントロールサンプルに、
細胞変性効果試験 (TCID50)を実施した。
その結果から次亜塩素酸水のノロウイルス不活化効果を判定しようとした。
さらに、ノロウイルス培養液のガラス表面塗布乾燥した汚染表面に対して、
次亜塩素酸水をスプレー噴霧した場合のTCID50測定を実施し、ノロウイルス表面汚染の不活化効果を判定した。

• 結果:次亜塩素酸水とノロウイルス液を等量混合した液ー液試験については、
次亜塩素酸水濃度が 200ppm の場合、
混合放置時間が1分間、10分間いづれの場合も感染性ウイルス残留率は各々0.74%以下0.01%以下で、
100ppm の場合と比較して1桁以上少ない。
スプレー噴霧試験について、噴霧後10分経過時の感染性ウイルス残留率は、
200ppmの場合3.3% 以下、600ppm の場合 0.5%以下であった。

2.方法

2-1. 測定条件

1) 試験ウイルス : マウスノロウイルス (MNV)
2) 試験消毒液 : 100,200,600ppm 次亜塩素酸水
3) 試験場所:仙台医療センターウイルスセンター
4) 日程 :2020年3月12日、3月12日~3月18日培養操作 (incubation) 、3月18日測定終了・結果報告書
5) 担当:ウイルス培養・感染価測定 Isolde Dapat ,PhD(ウイルスセンター)
温湿度消毒環境の設定と消毒操作 阪田(メディエアジャパン)

2-2.液ー液テストによるウイルス不活化試験

2-3.液ー表面テスト 噴霧 によるウイルス不活化試験

ガラス面にノロウイルス液が滴下された汚染表面"D"をさらに擦り付けて放置した汚染表面"S"に対して、
次亜塩素酸水(商品名ジアユーズ)をスプレー噴霧・吹き付ける。
1) スメアサンプルに対する次亜塩素酸水のスプレー噴霧
①ガラス面滴下ウイルス液の擦り付け操作

②スメアサンプルの3通りの処理
スメア操作後のガラスサンプルは3通りに処理され、20℃20%RH条件下に5分間放置。
コントロール:20℃20%RH条件下で純水を噴霧滴下、10分間放置する。
テスト1:次亜塩素酸水(商品名ジアユーズ)600ppmを噴霧滴下、10分間放置する。
テスト2:次亜塩素酸水(商品名ジアユーズ)200ppmを噴霧滴下、10分間放置する。

2)ウイルス感染価の回収
ラビング法:回収したガラスプレート上の付着液膜は、
噴霧液約0.8-0.9mℓ に浸したシリコンラバーを使用して、繰り返し擦りながら洗い出す。

2-4.細胞毒性試験手順

本報告書におけるマウスノロウイルスMNVの不活化効果の検証試験では、
ウイルスの増殖にマウスマクロファージ株細胞 RAW264.7を使用した。
図1の HClO の消毒剤Aをウイルス液Bと混合して、培養細胞RAW264.7に接種する際、
事前に培養細胞が消毒液Aの毒性によって細胞がダメージを受けない消毒液の濃度範囲をウイルスを使用しない細胞毒性試験で明らかにする必要がある。

培養細胞がダメージを受ける濃度条件下では、ウイルスが健全な細胞に感染して、
細胞変性を起こすか否かでウイルス感染価を判定するTCID50の手法そのものが適用できない。

3.結果

3-1.細胞変性効果試験(TCID50)結果

3-2.細胞毒性試験結果

図5の細胞毒性試験結果は、
200ppmにおいては、4倍希釈すれば細胞毒性が弱まり、600ppmにおいては、
16倍希釈して細胞毒性が弱まり、それぞれControlに近づく。

3-3.試験結果のまとめ

•次亜塩素酸水とノロウイルス液を等量混合した液ー液試験については、
次亜塩素酸水濃度が 200ppm の場合、混合放置時間が1分間、10分間いづれの場合も感染性ウイルス残留率は
各々0.74% 以下 以下で、100ppmの場合と比較して1桁以上少ない。

•スプレー噴霧試験について、噴霧後 10 分経過時の感染性ウイルス残留率は、
200ppmの場合 3.3% 以下、600ppm の場合 0.5% 以下であった。

二酸化塩素製剤によるO157に対する殺菌効力試験

*北生発26_0137号 平成26年8月27日
一般財団法人 北里環境科学センター

1.試験目的

各種「二酸化塩素製剤」の、O157に対する殺菌効力を確認することを目的とした。
尚、本試験は、試験品の基本的な殺菌効果を調べる試験系として、試験品原液に直接菌液を接種する方法を用いた。

2.依頼者

名称:株式会社FMI
所在地:〒101-0047東京都千代田区内神田3-21-8-502

3.試験機関

名称:一般財団法人 北里環境科学センター
所在地:〒252-0329 神奈川県相模原市南区北里1-15-1
担当:微生物部バイオ技術課

4.試験期間

平成26年8月19日~平成26年8月22日

5.試験品

1)対象品「安定化二酸化塩素(約300㎎/L)原液使用
2)開発品「バクテリサイド・クリーン」原液使用
(平成26年8月19日受領後、試験まで冷蔵・暗所保管した。)

6.試験条件

1)作用時間:0(初期)、15秒間、1分間
2)作用温度:25±2℃

7.使用培地および試薬

1)培地
①Tryotic Soy Agar(Difco、以下、TSAと記載)
②SCDLPブイヨン培地(栄研化学、以下、SCDLPと記載)

2)試薬
①塩化ナトリウム(和光純薬工業、以下、0.85%溶液を生理食塩液と記載)
②チオ硫酸ナトリウム(和光純薬工業、一級)
③アスクスーパー25(三菱ガス化学、以下、カタラーゼと記載)

8.試験菌と菌液の調製方法

1)試験菌
Escherichia coli(O157:H7)RIMD509939(腸管出血性大腸菌O157)

2)菌液の調製
凍結保存された菌株をTSAで36±2℃、24時間培養した。この培養菌を新たなTSAで
36±2℃、18時間培養した。発育した集落をかき取り、滅菌イオン交換水に懸濁し、
約10⁷CFU/mLに調製して試験に供した。

9.試験方法

1)殺菌効力試験
殺菌効力試験は以下の手順により行った。
50mL容量の遠心管に試験品10mLを分取し、25±2℃に保持した。
そこへ試験菌液0.1mLを加え、試験管ミキサーで混合して0(初期)、15秒間、1分間作用させた。
所定時間作用後、1mLを不活性化剤*¹ 9mLに添加して、試験菌に対する殺菌作用を停止させ、これを菌数測定用試料液とした。
作用時間0(初期)および陰性対照は、試験品のあ代わりに滅菌生理食塩液を用いた。

※1:不活性化剤として有効性を確認した2.5%カタラーゼ+0.3%チオ硫酸ナトリウム
添加SCDLPを用いた。試験品の不活性化剤としての有効性確認試験手順と結果を最終12項に示した。

2)菌数測定
菌数測定用試料液を原液として、滅菌生理食塩液で10倍段階希釈列を作製し、試料液原液
および希釈液の各1mLをシャーレに移し、TSA約20mLと混合、固化させて36±2℃で44時間培養した。
培養後、培地上に発育した集落を数えて、試験品1mLあたりの試験菌数を求めた(検出限界地10CFU/試験品1mL)。

3)濃度測定
上水試験補法2011年版、Ⅲ-2、13.4ヨウ素滴定法により、各試験品中の二酸化塩素(CIO₂)、亜塩素酸イオン(CIO₂‾)、塩素酸イオン(CIO₃‾)、残留塩素(CI₂)濃度を測定した。

10.試験結果

殺菌効力試験結果を表-1 および図-1 に示した。尚、表中には各作用時間後の陰性対照した。
また、各試験品中の各化学種濃度の結果を表-2に示した。
開発品「バクテリサイド・クリーン」は作用15秒後に、検出限界値未満(<10 CFU)となった。
対象品「安定二酸化塩素(約300㎎/L)」は作用15秒後および1分後はともに2.8×10⁵CFU/mLとなった。
尚、所定時間作用後の陰性対照菌数は、初期菌数から大きな変動はなく、試験系に問題がないことを確認した。

11.コメント

本試験では、各種「二酸化塩素製剤」のO157に対する殺菌効力を確認した。
その結果、開発品「バクテリサイド・クリーン」は、作用15秒後でLRVが4.3以上となり、本試験条件下での殺菌効力が認められた。
一方、対象品「安定化二酸化塩素(約300㎎/L)」は、殺菌効力が確認されなかった。

試験菌:Esherichia coli(O157:H7)RIMD509939
菌数単位:CFU/試験品1mL
検出限界値:10CFU/mL
※2:LRV(菌数対数減少値):logo₁₀(各作用時間の対照菌数÷試験品の菌数)

測定方法:上水試験方法2011年版、Ⅲ-2,13.4ヨウ素滴定法
単位:㎎/L

12.不活性化剤の有効性確認試験

1)目的
試験品による試験菌に対する殺菌作用を停止させる目的で使用する不活性化剤の有効性を確認した。

2)方法
不活性化剤(2.5%カタラーゼ+0.3%チオ硫酸ナトリウム添加SCDLP)9mLに試験品1mLを加え混合した(試験品10倍希釈)。
これに約10³~⁴CFU/mLの菌液を0.1mL接種し、常温で20分間作用させた後、この混合液の菌液を測定した。
尚、対照として、試験品のかわりに滅菌蒸留水(大塚製薬)を用いた。
不活性化剤の有効性は、第十六改正日本薬局方4.05-I-3.5に準拠し、下記判定基準によって判定した。

判定基準:B(不活性化剤処理後の菌数)/A(対象の菌数)×100=50~200%以内

3)結果
試験結果を表-3に示した。対照との菌数の比率は98~99%であり、12.2)項に示した判定基準以内であった為、不活性化剤は試験品に対して有効と判定した。

※3:B/A×100
※4:比率が50~200%以内で有効と判定した(第十六改正日本薬局方)


二酸化塩素製剤による枯草菌に対する殺菌効力試験

北生発26_0242号
平成27年1月7日

1.試験目的

各種二酸化塩素製剤の、枯草菌(芽胞)に対する殺菌効力を確認することを目的とした。
尚、本試験は、試験品の基本的な殺菌効果を調べる試験系として、試験品原液に直接菌液を接種する方法を用いた。

2.依頼者

名称:菱江科学 株式会社
所在地:〒103-0023東京都中央区日本橋本町4-12-20PMO日本橋本町

3.試験期間

名称:一般財団法人 北里環境科学センター
所在地:〒252-0329 神奈川県相模原市南区北里1-15-1
担当:微生物部バイオ技術課

4.試験期間

平成26年12月22日~平成26年12月24日

5.試験品

二酸化塩素製剤、以下2種
1)「開発品バクテリサイドグリーン300」原液使用
2)「安定化二酸化塩素300ppm」原液使用
(平成26年12月18日受領後、試験まで室温・暗所保管した。)

6.試験条件

1)作用時間:0(初期)、5分、15分、30分、60分
2)作用温度:25±2℃

7.使用培地および試薬

1)培地
①Tryptic Soy Agar(Difco、以下、TSAと記載)
②SCDLPブイヨン培地(栄研化学、以下、SCDLPと記載)

2)試薬
①塩化ナトリウム(和光純薬工業、以下、0.85%溶液を生理食塩液と記載)
②チオ硫酸ナトリウム(和光純薬工業、一級)
③アスクスーパ―25(三菱ガス化学、以下、カタラーゼと記載)

8.試験菌と菌液の調製方法

1)試験菌
Bacillus subtilis ATCC6633(枯草菌、芽胞液)
NAMSA社製Suspension,lot.GBS10-21,1.8×10⁹CFU/mL

2)菌液の調製
滅菌イオン交換水で、約10⁷CFU/mLに調製して試験に供した。

9.試験方法

1)殺菌効力試験
殺菌効力試験は以下の手順により行った。
50mL容量の遠心管に試験品10mLを分取し、25±2℃に保持した。
そこへ試験菌液0.1mLを加え、試験管ミキサーで混合して0(初期)、5分、15分、30分、60分間作用させた。
所定時間作用後、1mLを不活性化剤*¹ 9mLに添加して、試験菌に対する殺菌作用を停止させ、これを菌数測定用試料液とした。
作用時間0(初期)および対照は、試験品の代わりに滅菌生理食塩液を用いた。

※1:不活性化剤として有効性を確認した2.5%カタラーゼ+0.3%チオ硫酸ナトリウム
添加 SCDLPを用いた(既報、北生発26_1242号)。

2)菌数測定
菌数測定用試料液を原液として、滅菌生理食塩液で10倍段階希釈列を作成し、試料液原液および希釈液の各1mLをシャーレに移し、TSA約20mLと混合、固化させて36±2℃で42時間培養した。
培養後、培地上に発育した集落を数えて、試験品1mLあたりの試験菌数を求めた(検出限界値10CFU/試験品1mL)。

3)濃度測定
上水試験方法2011年版、Ⅲ-2、13.4ヨウ素滴定法により、各試験品中の二酸化塩素(CIO₂)、亜塩素酸イオン(CIO₂‾)、塩素酸イオン(CIO₃‾)、残留塩素(CI₂)濃度を測定した。

10.試験結果

殺菌効力試験結果を表-1および図-1に示した。尚、表中には各作用時間後の対照の菌数と、試験品の菌数から求めた菌数対数減少値(=LRV:log reduction value)を示した。
また、各試験品中の各化学種濃度結果を表-2に示した。
初期菌数は2.3×10⁵CFU/mLであった。「開発品バクテリサイドグリーン300」は作用5分後に1.5×10⁴CFU/mL、15分後に4.5×10¹CFU/mL、30分後に検出限界値未満(<10CFU)となった。
「安定化二酸化塩素300ppm」は作用60分後でも2.5×10⁵CFU/mLであり、対照の作用60分後の菌数と変わらなかった。
尚、所定時間作用後の対照菌数は、初期菌数から大きな変動はなく、試験系に問題がないことを確認した。

11.コメント

本試験では、各種二酸化塩素製剤の枯草菌に対する殺菌効力を確認した。
その結果。、「開発品バクテリサイドクリーン300」は、作用15分後でLRVが3.6となり、本試験条件下での殺菌効力が認められた。
一方、「安定化二酸化塩素300ppm」は、殺菌効力が確認されなかった。

以上

試験菌:Bacillus subtilis ATCC6633(枯草菌、芽胞菌)
菌数単位:CFU/試験品1mL
検出限界値:10CFU/mL
※2:LRV(菌数対数減少値):logo(各作用時間の対照菌数÷試験品の菌数)
LRVが0.1未満の場合は「-」と示す。

測定方法:上水試験方法2011年版、Ⅲ-2,13.4ヨウ素滴定法
単位:mg/L


除菌消臭材の犬パルボウイルスに対する不活化効果に関する試験

(試験番号:16-019)
一般財団法人生物科学安全研究所

試験の表題
除菌消臭剤の犬パルボウイルスに対する不活化効果に関する試験
(試験番号:16-019)

試験委託者
名称:株式会社FMI
所在地:〒101-0047東京都千代田区内神田3-21-8-502
委託責任者:代表取締役 松永 敏宏
委託担当者:代表取締役 松永 敏宏

試験実施施設:
名称:一般財団法人生物科学安全研究所
所在地:神奈川県相模原市緑区橋本台3丁目7番11号
代表者:理事長 萬田 富治(2016年6月21日まで)
         :理事長 濵岡 隆文(2016年6月21日から)
試験責任者:事業部 主任研究員 中島 隆二

試験期間
2016年4月25日~2016年6月27日

試験の目的

「奇跡の消臭・除菌剤 I Love Pet」の犬パルウイルスに対する不活化効果を確認することを目的とした。

試験材料

1)試験品 名称:奇跡の消臭・除菌剤 I Love Pet
性状:液体(有効成分 二酸化塩素)
ロット:160322
入手年月日:2016年4月28日
入手量:100mL×1本

2)対照品

名称:300ppm二酸化塩素製剤
性状:液体(有効成分 二酸化塩素)
ロット:160427
入手年月日:2016年4月28日
入手量:100mL×1本

3)供試ウイルス

名称:犬パルボウイルス(CPV)Cp49株
由来:東京大学大学院生命科学研究科・農学部 獣医微生物学教室から分与を受けた株を試験実施施設において猫腎継代細胞を用いて2代継代培養したもの。

ウイルス含有量:10⁷.²⁵TCD₅₀/mL
牛胎児血清(FBS)含有量:2%
保存条件:-70℃以下

4)供試細胞

ウイルスの定量に、以下の細胞を用いた。
名称:猫腎継代細胞(CRFK細胞)
由来:大日本住友製薬グループから購入し、試験実施施設において維持しているもの。

試験方法

1)試験品及び対照品
試験委託者から供給された原液を試験品及び対照品とはした。

2)供試ウイルス液の調製
供試ウイルスを希釈液[付記1]で10倍希釈し、FBS濃度が1%未満になるように調整したものを供試ウイルス液とした。

3)試験方法
試験品又は対照品と供試ウイルス液を99:1の割合で混合し(これを「試験試料」という。)
室温で感作させた。感作直後、感作後1分及び3分のウイルス含有量を測定した。
対照として、滅菌MilliQ水と供試ウイルス液を99:1で混合し(これを「対照試料」という。)
室温に置き、混合直後、1分後及び3分後のウイルス含有量を測定した。
試験の繰り返しは3回とした。

4)ウイルス含有量の測定
細胞培養フラスコに単層を形成したCRFK細胞をトリプシン処理し、細胞増殖用培養液[付記2]で細胞濃度を約2×10⁵個/mLに調製した。
この細胞浮遊液を24ウェルマルチプレートの各ウェルに0.5mLずつ播きこみ、試験試料または対照資料接種までの間、37℃、5%炭酸ガス孵卵器中に静置した。
感作終了後の試験試料および対照試料を細胞増殖用培養液で、10倍階段希釈し、上記の24ウェルマルチプレートに分注したCRFK細胞に1ウェル当たり0.1mL、1希釈当たり4ウェルに接種した。
37℃、5%炭酸ガス孵卵器で一夜培養した後、培養液を吸収除去し、1ウェル当たり0.5mLウイルス増殖用培養液[付記3]を加え、37℃、5%炭酸ガス孵卵器でさらに6日間培養した。
培養最終日に各ウェルから培養上清を0.025mL採取し、96ウェルV底プレートに写し、等量の牛血清アルブミン加ほう酸緩衝食塩液[付記7]を加え、さらに、VAD6.0液[付記8]で調製した0.5vo1%豚赤血球浮遊液[付記9]を0.05mL加えて4℃で一夜静置し、赤血球凝集(HA)反応の有無を観察した。
HA反応が認められた培養液をウイルス陽性とみなし、ベーレンス・ケルバー法にてウイルス含有量を算出した。

5)評価
以下の方法でLog Reduction Value(LRV)を算出した。
LRV=log₁₀A-logA-log₁₀B
A:対照試料のウイルス含有量
B:試験試料のウイルス含有量
LRVが2以上のとき有効と判定した。また、LRVが1以下の場合は、試験品はウイルス不活化効果がないものと判断した。

6)濃度測定
「上水試験方法2011年度版、Ⅲ-2、13.4ヨウ素滴定法」により、試験品及び対照品中の二酸化塩素(CIO₂)、亜塩素酸イオン(CIO₂‾)、塩素酸イオン(CIO₃‾)、残留塩素(CI₂)の濃度を測定した。
試験の繰り返しは3回とした。

試験成績及び結論

不活化効果試験成績を表1及び図1、濃度測定結果を表2に示す。
試験品と犬パルボウイルスを99:1の割合で混合し、室温で感作した結果、全ての時点においてLRVが2以上であった。
一方、対照品の結果は、全ての時点においてLRVが1以下であった。
以上の成績から試験品「奇跡の消臭・除菌剤 I Love Pet」は本試験系において、 犬パルボウイルスに対する不活化効果を有することが確認され、対照品「300ppm二酸化塩素製剤」の犬パルボウイルスに対する不活化効果は認められなかった。

[付記1]希釈液

1,000mL中
イーグルMEM(TPB含有)[付記4] 980mL
7%炭酸水素ナトリウム液 20mL

[付記2]細胞増殖用培養液

1,000mL中
イーグルMEM(TPB含有) 880mL
牛胎児血清 100mL
7%炭酸水素ナトリウム液 20mL

[付記3]ウイルス増殖培養液

1,000mL中
イーグルMEM(TPB含有) 960mL
牛胎児血清 20mL
7%炭酸水素ナトリウム液 20mL

[付記4]イーグルMEM(TPB含有)

イーグルMEM「ニッスイ」① 9.4g
(カナマイシン含有、日水製薬株式会社 製)
トリプトースホスフェイトブロス(Difco) 3.0g
MilliQ水 1L
溶解後、121℃、15分間高圧蒸気滅菌し、室温まで冷ました後、以下の試薬を加える。
L-グルタミン液[付記5] 10mL
ペニシリン・ストレプトマイシン液[付記6] 10mL

[付記5]L-グルタミン液

L-グルタミン液を200mMを含む液体

[付記6]ペニシリン・ストレプトマイシン液

1mL中に、ペニシリン10,000IU、ストレプトマイシン10,000μg力価を含む液体

[付記7]牛血清アルブミン加ほう酸緩衝食塩液

1,000mL中
塩化ナトリウム 7.01g
ほう酸 30.5g
水酸化ナトリウム 0.96g
水 残量

牛血清アルブミンを0.2w/v%となるように加えた後、水酸化ナトリウムでpHを9.0に調節する。

[付記8]VAD6.0液

1,000mL中
塩化ナトリウム 8.77g
無水りん酸水素ナトリウム 5.68g
りん酸二水素ナトリウム二水和物 40.56g
水 残量

牛血清アルブミン加ほう酸緩衝食塩液[付記7]と等量混合したとき、pH6.0になるように調整する。

[付記9]0.5vo1%豚赤血球浮遊液

健康な豚からアルスバー液中に採血して得た血液を、VAD6.0液[付記8]で、3回洗浄した後、VAD6.0液で0.5vo1%となるように調製したもの。

牛血清アルブミン加ほう酸緩衝食塩液[付記7]と等量混合したとき、pH6.0になるように調整する。